Платформа точно определяет количество антигенов, представленных на поверхности клеток

Платформа точно определяет количество антигенов, представленных на поверхностях клеток
                Аспирант и ведущий автор Лорен Стопфер в лаборатории. Кредит: Лорен Стопфер

Обычно иммунная система способна различать здоровые и аномальные клетки. Пептиды, фрагменты, созданные в результате синтеза и расщепления белков внутри каждой клетки, представлены на поверхности в качестве антигенов и действуют как сигналы для иммунных клеток, следует ли оставить клетку в покое или пометить для уничтожения и удаления.
                                                                                       

Поскольку раковые клетки содержат небольшое количество ассоциированных с опухолью антигенов и антигенов, возникающих в результате генетических мутаций, они могут стать мишенью для иммунной системы. Однако раковые клетки могут разработать стратегии уклонения от обнаружения иммунной системой. Иммунотерапия рака противодействует этим стратегиям, но только для некоторых видов рака и только для некоторых пациентов. Те, которые работают, дают хорошие результаты.

Исследователи и клиницисты изучают, как улучшить показатель успешности иммунотерапии для большего количества типов рака и пациентов. В этих усилиях они комбинируют иммунотерапию с таргетной терапией, небольшими молекулами, предназначенными для ингибирования выбранных белков-мишеней в клетке. Для разработки эффективных комбинаций необходимо лучшее понимание того, как целевая терапия изменяет иммунопептидом — репертуар пептидных антигенов, представляющих поверхность.

Команда исследователей, включая членов Института Коха Фореста Уайта, профессора Неда С. и Джанет Бемис Райс, а также члена Центра точной онкологической медицины Массачусетского технологического института, и Дугласа Лауффенбургера, профессора биологической инженерии, химической инженерии и биологии Форда, разработал методику точного количественного определения изменений в иммунопептидоме.

В исследовании, проведенном аспирантом Лорен Стопфер и появившимся в Nature Communications, исследователи использовали платформу для анализа влияния ингибиторов CDK4/6, класса известных противораковых агентов, на иммунопептидом клеточные линии меланомы. В дополнение к выявлению потенциальных антигенных мишеней для разработки лекарств, их результаты выявили потенциал ингибиторов CDK4/6 в качестве эффективного партнера для определенных видов иммунотерапии. В конечном счете, платформа может помочь исследователям рака разработать новые целевые препараты и иммунотерапию или клинические испытания для комбинаций этих видов терапии.

Качественная количественная оценка

В настоящее время для изучения того, как клетка меняет свой иммунопептидом в ответ на воздействие лекарственного средства или другое возмущение, исследователи выполняют метод, известный как масс-спектрометрия, для количественного определения кратного изменения или относительного изменения величины между последующими измерениями экспрессия пептидных антигенов. Однако большинство современных методов масс-спектрометрии не дают полной или даже надежно точной картины динамики иммунопептидома.

Процесс подготовки образца для масс-спектрометрического анализа может привести к значительным потерям антигенов. При выделении относительно небольшого количества антигенных пептидов из всего содержимого клеток может иметь место значительный разброс в пропорции пептидных антигенов, извлеченных из образца в образец или из пептида в пептид. Существующие методы учета количества потерянных антигенов трудоемки и имеют ограниченную эффективность.

Один только Foldchange не указывает величину изменения уровней пептидного антигена. Например, трехкратное увеличение антигенов может означать увеличение с 10 до 30 антигенов, или это может означать увеличение от 1000 до 3000. Поскольку разные лекарства требуют наличия разных антигенов в разных количествах, чтобы быть эффективными, точный подсчет изменения антигена необходим для определения лекарств, которые вызывают оптимальный ответ в клетке. Кроме того, измерение может быть подорвано основным «шумом» в образце — данными, которые могут омрачить относительную долю наблюдаемого «сигнала», генерируемого интересующим антигеном.

«Люди скажут, что вам нужно определенное количество пептидного антигена для того, чтобы иммунотерапия работала, но сейчас это число обычно основано на неофициальных данных», — говорит Уайт. «Для принятия действительно обоснованных решений о вариантах иммунотерапии необходим способ очень точно и очень надежно определять количество антигенов».

Новая платформа обеспечивает точное количественное определение пептидных антигенов, представленных на клеточной поверхности, с учетом изменений в обработке образцов и дает абсолютное количество обнаруживаемых пептидов. Используя широко доступную технологию на основе ультрафиолетового света, этот метод вводит пептиды, загруженные тяжелыми изотопами, в генно-инженерные версии молекул, которые представляют антигены на клеточной поверхности, основные комплексы гистосовместимости класса I (МНС). Комплексы меченого пептида-MHC (pMHC) затем добавляют к образцам содержимого целых клеток. Когда антигенные пептиды экстрагируются, пептиды, меченные тяжелым изотопом, могут использоваться для учета того, сколько антигенов было потеряно для обработки.

Чтобы определить, сколько специфического антигена представлено в клетках, pMHC, меченные тяжелым изотопом, могут быть добавлены к образцам содержимого клеток в различных концентрациях. Полученную стандартную кривую или график можно использовать для экстраполяции количества пептидных антигенов.

Подсчет антигенов

Исследователи использовали новую платформу для количественной оценки того, как ингибиторы CDK4/6 изменяют репертуар антигенов, представленных на поверхности клеток меланомы.

Меланому можно эффективно лечить с помощью класса иммунотерапии, называемого ингибиторами блокады иммунной контрольной точки, но до 40 процентов пациентов не реагируют на эту терапию. Недавние исследования показали, что иммунотерапия блокады контрольных точек может быть более эффективной у большего количества пациентов в сочетании с другими противораковыми средствами, особенно теми, которые стимулируют иммунный ответ, такими как ингибиторы CDK4/6. Считается, что ингибиторы CDK4/6 усиливают ответ иммунной системы на рак частично за счет увеличения экспрессии МНС, тем самым делая раковые клетки более видимыми для иммунной системы.

Исследователи представили репертуары пептидных антигенов в четырех клеточных линиях меланомы, обработанных ингибитором CDK4/6 пальбоциклибом в низких и высоких дозах, и обнаружили, что низкие дозы пальбоциклиба приводят к большему увеличению уровня МНС, чем при терапии более высокими дозами. При более низких дозах иммунопептидом показал увеличение ассоциированных с опухолью пептидных антигенов, полученных из внутриклеточных путей, о которых известно, что они подвержены ингибированию CDK4 и CDK6. Эти результаты дополняют растущее количество доказательств того, что CDK4/6 можно использовать вместе с блокадой контрольных точек для повышения способности иммунной системы реагировать на опухоли, и указывают на то, что ингибиторы CDK4/6 и другие подобные им методы лечения можно использовать для настройки, какие пептиды представлены иммунной системе.

Исследователи также смогли идентифицировать антиген, серин-фосфорилированный пептид IRS2, который встречается исключительно в злокачественных опухолях. Они обнаружили, что он был выражен на высоком уровне, демонстрируя, что платформа может также использоваться, чтобы помочь исследователям рака определить цели иммунотерапии.

Благодаря своей чувствительности и скорости, новая платформа может использоваться в клинике для разработки стратегий лечения для конкретного пациента. Мультиплексная платформа может анализировать множество образцов в тандеме, что позволяет использовать кратковременную шкалу, необходимую для клинических испытаний. Его чувствительность позволяет использовать его на небольших образцах, включая образцы опухолей отдельных пациентов. Анализ изменений репертуара пептидного антигена может быть использован для оптимизации порядка и сроков терапии для достижения наибольшего эффекта, в дополнение к калибровке презентации антигена раковых клеток для нацеливания иммунотерапией.

«Одним из наиболее многообещающих приложений для этого инструмента является лучшее понимание того, сколько из этих пептидных антигенов-мишеней представлено не только на клеточных линиях, но и в реальных опухолях», — говорит Стопфер. «Знание того, сколько антигена присутствует в опухолевых клетках, может сообщить, какие виды терапии мы разрабатываем, и нашу способность принимать обоснованные решения о вариантах иммунотерапии».

Spread the love